恒奥德仪器紫外分光光度计仪器组成 测定方法

仪器组成

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

光谱范围

包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200～400 nm的紫外光区。不同的光源都有其*的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。

分光光度计图片

分光光度计图片(4张)

钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙，黄绿，蓝靛，紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源。

氢灯（或氘灯）的发射光谱:氢灯能发出185～400 nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源。

蛋白质的直接定量（UV法）

这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在些杂质，般要消除320nm 的“背景"信息，设定此能“开"。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移"。这是个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较。

比色法蛋白质定量

蛋白质通常是多种蛋白质的混合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

测定方法

比色方法

般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。

Lowry 法：以早期的Biuret 反应为基础，并有所改。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：这是种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系较强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其大的特点是，敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。主要的缺点是不同的标准品会导致同样品的结果差异较大，无可比性。