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北京恒奥德仪器仪表有限公司
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恒奥德仪器紫外分光光度计仪器组成 测定方法
点击次数:356      更新时间:2023-03-20

恒奥德仪器紫外分光光度计仪器组成 测定方法

 

仪器组成

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

光谱范围

包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200400 nm的紫外光区。不同的光源都有其*的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。

分光光度计图片

分光光度计图片(4)

钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源。

氢灯(或氘灯)的发射光谱:氢灯能发出185400 nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源。

 

蛋白质的直接定量(UV法)

这种方法是在280nm波长,直接测试蛋白。选择Warburg 公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,测试空白液,然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在些杂质,般要消除320nm 背景"信息,设定此能"。与测试核酸类似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时,发现读数漂移"。这是个正常的现象。事实上,只要观察A280的吸光值的变化范围不过1%,表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度,乘以定的系数,只要吸光值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较。

比色法蛋白质定量

蛋白质通常是多种蛋白质的混合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。

测定方法

比色方法

般有BCABradfordLowry 等几种方法。

Lowry 法:以早期的Biuret 反应为基础,并有所改。蛋白质与Cu2 反应,产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比,Lowry 法敏感性更。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含EDTATriton x-100ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。

BCABicinchoninine acid assay)法:这是种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ,后者与BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系较强,反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法,操作简单,敏感度。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

Bradford 法:这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应,产生的有色化合物吸收峰595nm。其大的特点是,敏感度好,是Lowry BCA 两种测试方法的2 倍;操作更简单,速度更快;只需要种反应试剂;化合物可以稳定1小时,方便结果;而且与系列干扰LowryBCA 反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的。主要的缺点是不同的标准品会导致同样品的结果差异较大,无可比性。