HAD-V5YX 分光光度计原理操作方法

原理

分光光度计采用个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：

A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc

式中 :A 为吸光度；

I0为入射的单色光强度；

I 为透射的单色光强度；

T 为物质的透射率；

k 为摩尔吸收系数；

L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长；

c 为物质的浓度；

蛋白质的直接定量（UV法）

这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在些杂质，般要消除320nm 的“背景"信息，设定此能“开"。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移"。这是个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较。

比色法蛋白质定量

蛋白质通常是多种蛋白质的混合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

比色方法

般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。

Lowry 法：以早期的Biuret 反应为基础，并有所改。蛋白质与Cu2 反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret 相比，Lowry 法敏感性更。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：这是种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2 反应产生Cu ，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系较强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

操作方法

1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。

2.将灵敏度开关调至“1"档（若零点调节器调不到“0"时，需选用较。）

3.根据所需波长转动波长选择钮。

4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。

5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘针向t=0处。

6.盖上暗箱盖，调节“100"调节器，使空白管的t=100，针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。

7.比色毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。