凯氏定氮仪是根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量的仪器。因其蛋白质含量测量计算的方法叫做凯氏定氮法，故被称为凯氏定氮仪，又名定氮仪、蛋白质测定仪、粗蛋白测定仪。

　　原理

　　将有机化合物与硫酸共热使其中的氮转化为硫酸铵。在这步中，经常会向混合物中加入硫酸钾来提中间产物的沸点。样本的分析过程的终点很好判断，因为这时混合物会变得无色且透明（开始时很暗）

　　在得到的溶液中加入少量氢氧化钠，然后蒸馏。这步会将铵盐转化成氨。而总氨量（由样本的含氮量直接决定）会由反滴定法确定：冷凝管的末端会浸在硼酸溶液中。氨会和酸反应，而过量的酸则会在甲基橙的示下用碳酸钠滴定。滴定所得的结果乘以定的转换因子就可以得到结果。

　　使用步骤

　　消化

　　1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液1.0mL，样品要加到烧瓶底，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g，浓硫酸2.0mL，30%过氧化氢1.0mL。4、5、6号烧瓶作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水1.0mL代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能入底，以保证样品消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中行。消化后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。

　　蒸馏吸收

　　蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三分组成。

　　1、仪器的洗涤

　　仪器安装前，各件需经般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在只铁架台上。仪器使用前，微量管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸气洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石（或毛细管等），以防沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸气只能入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置个锥形瓶接收冷凝水。从定氮发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。冲洗毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下换放个盛有硼酸-示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口浸没在溶液中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测样品使用。

　　2、无机氮标准样品的蒸馏吸收

　　由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸馏和滴定的操作，初学者宜用无机氮标准样品行反复练习，再行有机氮未知样品的测定。常用巳知浓度的标准硫酸铵测试三次。取洁净的100mL锥形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基蓝-甲基红混合示剂（呈紫红色）3～4滴，盖好瓶口待用。取其中只锥形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶液中。注意：在此操作之前打开收集器活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。准确吸取2mL硫酸铵标准液加到玻杯中，小心提起棒状玻塞使硫酸铵溶液慢慢入蒸馏瓶中，用少量蒸馏水冲洗小玻杯3次，并放人蒸馏瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液，使碱液慢慢入蒸馏瓶中，在碱液尚未入时，将棒状玻塞盖紧。向小玻杯中加约5mL蒸馏水，再慢慢打开玻塞，使半水入蒸馏瓶，半留在小玻杯中作水封。关闭收集器活塞，加热蒸气发生器，行蒸馏。锥形瓶中的硼酸-示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。自变色时起，再蒸馏3～5min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约lcm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏1min，移开锥形瓶，盖好，准备滴定。在次蒸馏毕后，移去煤气灯，夹紧蒸气发生器与收集器间的橡胶管，排除反应毕的废液，用水冲洗小玻杯几次，并将废液排除。如此反复冲洗干净后，即可行下个样品的蒸馏。按以上方法用标准硫酸铵再做两次。另取2mL蒸馏水代替标准硫酸铵行测定二次。将各次蒸馏的锥形瓶起滴定。

　　3、未知样品及的蒸馏吸收

　　将消化好的蛋白样品三支，对照液三支，依次作蒸馏吸收。加5mL热的蒸馏水至消化好的样品或对照液中，通过小玻杯加到反应室中，再用热蒸馏水洗涤小玻杯3次，每次用水量约3mL，洗涤液并倒入反应室内。其余操作按标准硫酸铵的蒸馏行。由于消化液内硫酸钾浓度而呈粘稠状，不易从凯氏烧瓶内倒出，加入热蒸馏水5 mL稀释之，如果有结晶析出，微热溶解，趁热加入玻杯，使其入反应室。此外，还应当注意趁仪器洗涤尚未冷却时立即加入样品或对照液，否则消化液通过冷却的管道容易析出结晶，成堵塞。